Western-blot
A vázizom Ca2+-homeosztázisában
fontos szerepet játszó fehérjék (pl. rianodinreceptor, SERCA pumpa,
calsequestrin, STIM1) kimutatása mellett a CB1 és CB2 receptor expresszióját
hasonlítjuk össze kontroll és CB1-KO egerekből izolált izommintákban,
Western-blot technika segítségével. Loading kontrollként aktint használunk
azokban az esetekben, amikor a másik kimutatni kívánt fehérje molekulasúlya ezt
lehetővé teszi.
A mintaként használt
teljes sejt lizátumokat Western-blot analízissel vizsgáljuk. 1/5 térfogatú,
5-szörös töménységű elektroforézis mintapuffert (310 mM
Tris-HCl, pH 6,8; 10% SDS, 50%
glicerol, 100 mM
DTT, 0,01 % brómfenol-kék) adunk a sejtlizátumokhoz, majd 5 percig 80 °C-on
főzzük őket. Azonos mennyiségű, 20-40 µg fehérjét választunk szét 7,5 vagy
10%-os nátrium-dodecilszulfát-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) gélen
a vizsgált fehérjék immunológiai detektálásához. Ezután a fehérjéket
elektroforézis segítségével transzferáljuk nitrocellulóz membránra. Az
aspecifikus kötőhelyeket PBS-ben oldott 5%-os sovány tejporral blokkoljuk, majd
4 ºC-on, egész éjszakán keresztül inkubáljuk az elsődleges antitestekkel,
melyeket tejporos blokkoló oldatban hígítunk. Ezután 3-szor 10 perc PBST-vel
(PBS kiegészítve 0,1% Tween 20 reagenssel) történő mosás következik, majd a
membránokat 1 órán keresztül inkubáljuk a másodlagos antitestekkel. Másodlagos
antitestként az elsődleges antitestet termelő faj (nyúl vagy egér) ellen
kecskében termeltetett, tormaperoxidázzal (HRP) konjugált IgG-t használunk 5%
sovány tejport tartalmazó PBS-ben 1:1000 arányban hígítva. A jeleket megnövelt
kemilumineszcens (ECL) reakcióval hívjuk elő, az intézetünkben rendelkezésünkre
álló Gel Logic 1500 előhívó rendszerrel.
A
kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális
Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú
„Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi
támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című
kiemelt projekt keretei között valósult meg.
