Western-blot

Western-blot

A vázizom Ca²⁺-homeosztázisában fontos szerepet játszó fehérjék (pl. rianodinreceptor, SERCA pumpa, calsequestrin, STIM1) kimutatása mellett a CB1 és CB2 receptor expresszióját hasonlítjuk össze kontroll és CB1-KO egerekből izolált izommintákban, Western-blot technika segítségével. Loading kontrollként aktint használunk azokban az esetekben, amikor a másik kimutatni kívánt fehérje molekulasúlya ezt lehetővé teszi.

A mintaként használt teljes sejt lizátumokat Western-blot analízissel vizsgáljuk. 1/5 térfogatú, 5-szörös töménységű elektroforézis mintapuffert (310 mM Tris-HCl, pH 6,8; 10% SDS, 50% glicerol, 100 mM DTT, 0,01 % brómfenol-kék) adunk a sejtlizátumokhoz, majd 5 percig 80 °C-on főzzük őket. Azonos mennyiségű, 20-40 µg fehérjét választunk szét 7,5 vagy 10%-os nátrium-dodecilszulfát-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) gélen a vizsgált fehérjék immunológiai detektálásához. Ezután a fehérjéket elektroforézis segítségével transzferáljuk nitrocellulóz membránra. Az aspecifikus kötőhelyeket PBS-ben oldott 5%-os sovány tejporral blokkoljuk, majd 4 ºC-on, egész éjszakán keresztül inkubáljuk az elsődleges antitestekkel, melyeket tejporos blokkoló oldatban hígítunk. Ezután 3-szor 10 perc PBST-vel (PBS kiegészítve 0,1% Tween 20 reagenssel) történő mosás következik, majd a membránokat 1 órán keresztül inkubáljuk a másodlagos antitestekkel. Másodlagos antitestként az elsődleges antitestet termelő faj (nyúl vagy egér) ellen kecskében termeltetett, tormaperoxidázzal (HRP) konjugált IgG-t használunk 5% sovány tejport tartalmazó PBS-ben 1:1000 arányban hígítva. A jeleket megnövelt kemilumineszcens (ECL) reakcióval hívjuk elő, az intézetünkben rendelkezésünkre álló Gel Logic 1500 előhívó rendszerrel.

http://www.bio-rad.com/en-us/sku/170-3836-mini-trans-blot-cell-powerpac-hc-power-supply

 

A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.