2014. december 19., péntek

Konfokális mikroszkópia



Konfokális mikroszkópia

Kísérleteink során a Zeiss LSM 510 META ill. LSM 5 Live konfokális mikroszkópokat line-scan üzemmódban használjuk. A Rhod-2 Ca2+-kötő festékkel feltöltött FDB izomrostokról felvett kétdimenziós x-y képen egy, a rost hossztengelyével párhuzamos vonalat húzunk számítógépes program segítségével. A konfokális mikroszkóp lézere ezután ezen a vonalon pásztázik az általunk megadott paraméterek szerint. Az így kapott kép az adott vonalon a mérés alatt végbement fluoreszcenciaintenzitás-változást mutatja be az idő függvényében. A felvételek fluoreszcenciáját (F) az alap fluoreszcenciára (F0; a sejtek nyugalmi fluoreszcencia-intenzitása a tranziensek előtt) normalizáljuk, majd a tranziensek amplitúdóját deltaF/F0-ként határozzuk meg. A line-scan üzemmódban készített felvételeket az izomrostok elektromos ingerlésével kiváltott Ca2+-tranziensek rögzítésére használjuk.
 


Az ábra bal oldalán egy L6 myoblast tenyészet x-y képe látható, a sárga vonal jelöli a line-scan mérés helyét. A mérés során a mikroszkóp lézere csak ezen a vonalon pásztázik, és rögzíti a fluoreszcencia-intenzitás változását az idő függvényében. A jobb oldalon látható a kész line-scan kép, aminek a függőleges tengelye mutatja a sárgával jelölt vonal egyes pixeleinek a fluoreszcencia intenzitását az adott időpillanatban, a vízszintes tengelye pedig ennek a megváltozását az idő függvényében.





A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

2014. december 3., szerda

Egyedi sejteken történő fluoreszcens, intracelluláris [Ca2+]-mérés



Egyedi sejteken történő fluoreszcens, intracelluláris [Ca2+]-mérés

A C2C12 sejtek ill. FDB izomrostok intracelluláris [Ca2+] változásait Fura-2-AM fluoreszcens Ca2+-kötő festék segítségével mérjük. A feltöltést 37 °C-on, termosztátban, 60 percen át végezzük. A sejtekbe juttatott festék 340 és 380 nm hullámhosszúságok között váltakozó gerjesztését a Photon Technology International (PTI) Delta ScanTM kettős monokromátoros berendezés biztosítja. A Fura-2 által kibocsátott fluoreszcens fényt 510 nm-en interferenciaszűrő közbeiktatásával egy fotoelektron-sokszorozó (PMT) segítségével detektáljuk. A két hullámhosszon történő gerjesztés során mért fluoreszcencia-értékek hányadosából (R=F340/F380) az alábbi egyenlet alapján számítjuk ki az intracelluláris [Ca2+]-t: [Ca2+]i=KD∙β∙(R-Rmin)/(Rmax-R). A sejteket illetve izomrostokat folyamatosan perfundáljuk normál Tyrode-oldattal egy külső perfúziós rendszer segítségével, és a különböző mérőoldatokat egy lokálperfúziós rendszeren keresztül adagoljuk közvetlenül a vizsgálni kívánt sejtekre.



A PTI Delta Scan mérőrendszer felépítése. A sejtekben lévő Ca2+-érzékeny festéket 340 és 380 nm hullámhosszon gerjesztjük, majd az emissziót 510 nm-en detektálva, a hányadosukból az intracelluláris Ca2+-koncentráció kiszámítható.



A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.