C2C12 sejtvonal

C2C12 sejtvonal

A C2C12 a Yaffe és mtsai. által 1977-ben létrehozott egér vázizom eredetű myoblast sejtvonal egyik szubklónja (Yaffe & Saxel 1977, Blau et al. 1983). A sejtek a felnőtt C3H egértörzs lábának harántcsíkolt izomzatából nyert immortalizált myoblastok, melyek lószérum hatására myotubulusokat képeznek. A differenciáltatást 90%-os sejtsűrűségnél kell megkezdeni, ugyanis ezen mértékű denzitás biztosítja a sejtfúziót megelőző sejt-sejt interakció meglétét.

A myoblast tenyészet fenntartásához és a proliferációjuk elősegítéséhez a DMEM tápoldatot 10% FBS-sel, 50 U/ml penicillinnel, és 50 µg/ml streptomycinnel egészítjük ki. A kísérleteinkhez a tenyészetet izomcsövekké differenciáltatjuk, miután elérték az ehhez szükséges 80-90%-os konfluenciát. A differenciálódás elindítása a tápoldat összetételének módosításával történik, melynek során a 10% FBS-t – a többi összetevőt nem változtatva – 5% lószérumra (HS) cseréljük. A kísérleteket 5-6 napos differenciált myotubulusokon végezzük (Oláh et al. 2011).

 6 napos, terminálisan differenciálódott C2C12 myotubulusok

Irodalom:

Blau HM, Chiu CP, Webster C: Cell. 1983 Apr;32(4):1171-80.

Oláh T, Fodor J, Ruzsnavszky O, Vincze J, Berbey C, Allard B, Csernoch L: Cell Calcium. 2011 Jun;49(6):415-25.

Yaffe D, Saxel O: Nature. 1977 Dec 22-29;270(5639):725-7.






A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

CB1-KO egerek

CB1-KO egerek

A CB1 kannabinoid receptorok funkciójának vizsgálatához Zimmer és munkatársai (Zimmer et al. 1999) létrehoztak egy sérült CB1 génnel rendelkező egértörzset. A CB1 receptor kódoló szekvenciáját egyetlen nagy exon tartalmazza. A CB1 receptor hiányos egerek létrehozásakor Zimmer és munkatársai PGK-neo-ra cserélték a CB1 kódoló szekvenciájának nagy részét (a 32-448. aminosavak közötti részt), embrionális őssejtek homológ rekombinációja segítségével.

A CB1 knockout (CB1-KO) egerek egészségesnek és szaporodóképesnek mutatkoztak, azonban szignifikánsan nagyobb volt a mortalitásuk a kontroll C57BL/6 egerekhez képest. Ezen felül csökkent lokomotoros aktivitást, megnövekedett gyűrű-katalepsziát, valamint a hot-plate tesztekben és formalin-tesztekben hipoalgéziát mutattak (Zimmer et al. 1999).

Irodalom:

Zimmer A, Zimmer AM, Hohmann AG, Herkenham M, Bonner TI: Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 May 11;96(10):5780-5.






A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

C57BL/6 kontroll egerek

Az irodalmi háttér áttekintése után, a következő blogbejegyzéseimben a kutatásom során használt kísérleti állatokról, mérőrendszerekről és módszerekről fogok írni.

C57BL/6 kontroll egerek

A C57BL/6 egértörzs, amit gyakran neveznek „C57 black 6”-nek, „C57”-nek, vagy „black 6”-nek, az utóbbi 80 év legszélesebb körben használt laboratóriumi egértörzse. A beltenyésztett C57BL egereket 1921-ben fejlesztette ki C. C. Little, aki a Miss Abbie Lathrop készletéből származó 57-es számú nőstényt keresztezte az 52-es számú hímmel. Az így született 10 altörzs közül a 6-os altörzs volt a legnépszerűbb. A genetikailag módosított egértörzsekhez leggyakrabban ezt a törzset használják genetikai háttérként. Népszerűsége annak is köszönhető, hogy jól szaporítható, hosszú életű, és kevéssé hajlamos a tumorképzésre. A C57BL/6 egereknek sötétbarna, majdnem fekete szőrzete van. Érzékenyebbek a zajra, és hajlamosabbak a harapásra is, mint a szelídebb laboratóriumi egértörzsek, pl. a BALB/c. A C57BL/6 egértörzs volt a második olyan emlősfaj, aminek a teljes genomját publikálták. Kutatásunk során az itt felsorolt jó tulajdonságai mellett azért ezt az egértörzset használtuk, mert ez képezi a genetikai hátterét a Zimmer és munkatársai által kifejlesztett CB1-KO egértörzsnek (Zimmer et al. 1999).

Irodalom:

http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html

http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/c57bl-6n-mouse

http://en.wikipedia.org/wiki/C57BL/6

Zimmer A, Zimmer AM, Hohmann AG, Herkenham M, Bonner TI: Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 May 11;96(10):5780-5.  






A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

A CB1 receptor szerepe vázizomban

A CB1 receptor szerepe vázizomban

A CB1 agonistáknak és antagonistáknak a vázizom energiaháztartására és glükózmetabolizmusára gyakorolt hatásainak vizsgálatáról számtalan cikk született már, azonban a vázizom kontrakciós sajátságait befolyásoló hatásukról alig, a Ca²⁺-homeosztázisára kifejtett hatásukról pedig egyáltalán nem található irodalom. Az izom a glükóz-oxidáció egyik igen fontos helyszíne. Elhízott egyénekben az endokannabinoidok szintje és a vázizmok CB1R expressziója megnő, mely inzulinrezisztenciát és a glükózfelvétel csökkenését okozza (Pagotto et al. 2006, Esposito et al. 2008, Taube et al. 2009). A CB1R gátlása csökkenti az inzulinrezisztenciát, fokozza a glükózfelvételt az izomban, ezáltal megnöveli a test energiakiadását és csökkenti a testsúlyt (Crespillo et al. 2011). Ez a folyamat PKA-függő módon zajlik le, a foszfatidilinozitol 3 kináz (PI3K) expressziójának és aktivitásának, valamint az inzulin által kiváltott extracelluláris szignál-regulált kináz (ERK) aktivitásának fokozásával (Lipina et al. 2010).

A kannabinoid receptorok működésének izomkontrakcióra kifejtett hatásairól jóval kevesebb információ található az irodalomban. Megfigyelték, hogy a CB1 receptorok aktiválása csökkenti, gátlásuk fokozza a kezelt állatok lokomotoros aktivitását (Zimmer et al. 1999, Huerta et al. 2009), amely hatások azonban nem csak központi idegrendszeri eredetűek, hanem közvetlenül a vázizmon kifejtettek is lehetnek (Huerta et al. 2009). Érdekes, hogy a CB1 receptort nem expresszáló „knockout” (KO) egereknél szintén hipoaktivitást – a mozgékonyság csökkenését – figyeltek meg (Zimmer et al. 1999), ami arra utal, hogy a CB1R rövidtávú gátlása és krónikus hiánya egymással ellentétes hatású, feltehetően a krónikus hiánynál fellépő különböző kompenzációs mechanizmusok miatt. Béka gyors és lassú izomrostokon kimutatták, hogy a koffein által kiváltott kontraktúrák erejét csökkentette a CB1 agonistákkal történő előkezelés (Huerta et al. 2009).

Mint a fentiekből látható, a CB1 vázizomban betöltött szerepéről még korántsem tudunk mindent, és a rendelkezésünkre álló információk egy része is ellentmondásos. Kutatásunk során ezt a képet szeretnénk teljesebbé tenni, ami később a gyógyszerként használt kannabinoid anyagok mellékhatásainak alaposabb megismeréséhez is hozzájárulhat.

Irodalom:

Crespillo A, Suárez J, Bermúdez-Silva FJ, Rivera P, Vida M, Alonso M, Palomino A, Lucena MA, Serrano A, Pérez-Martín M, Macias M, Fernández-Llébrez P, Rodríguez de Fonseca F: Biochem J. 2011 Jan 1;433(1):175-85.

Esposito I, Proto MC, Gazzerro P, Laezza C, Miele C, Alberobello AT, D'Esposito V, Beguinot F, Formisano P, Bifulco M: Mol Pharmacol. 2008 Dec;74(6):1678-86.

Huerta M, Ortiz-Mesina M, Trujillo X, Sánchez-Pastor E, Vásquez C, Castro E, Velasco R, Montoya-Pérez R, Onetti C: J Membr Biol. 2009 May;229(2):91-9.

Lipina C, Stretton C, Hastings S, Hundal JS, Mackie K, Irving AJ, Hundal HS: Diabetes. 2010 Feb;59(2):375-85.

Pagotto U, Marsicano G, Cota D, Lutz B, Pasquali R: Endocr Rev. 2006 Feb;27(1):73-100.

Taube A, Eckardt K, Eckel J: Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009 Nov;297(5):E1004-12

Zimmer A, Zimmer AM, Hohmann AG, Herkenham M, Bonner TI: Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 May 11;96(10):5780-5.





A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

Endokannabinoid rendszer a vázizomban

Endokannabinoid rendszer a vázizomban

Szervezetünkben endogén módon is termelődnek kannabinoid anyagok (a legismertebbek az anandamide és a 2-arachidonoyl glycerol), melyek fontos szerepet töltenek be az idegrendszeri jelátviteli folyamatokban, a hangulat befolyásolásában, az érző és motoros működésben, az immunfolyamatok modulálásában, a bőrsejtek proliferációjában és differenciálódásában, a kardiovaszkuláris és az endokrin rendszer szabályozásában (Pagotto et al. 2006, Valverde et al. 2012, Bíró et al. 2009). Ezen anyagok receptorai a kannabinoid receptorok. A CB1 receptor (CB1R) nagyobb mennyiségben főleg a neuronokon és az agyban található meg, azonban a legtöbb egyéb szövetben is megfigyelhető az expressziója. Sejttípustól függően, sőt adott sejten belül is különböző G-proteinekkel (G_i/o, G_q, ill. G_s) állhat kapcsolatban (Turu & Hunyady 2010, Lauckner et al. 2005). A CB2 receptor (CB2R) az immunsejtekben és a perifériás szövetekben gyakoribb, de az idegrendszerben is megtalálható (Howlett 2005, Pertwee et al. 2010).

Mindkét receptor, valamint az endokannabinoidok szintéziséért és lebontásáért felelős enzimek (diacilglicerol-lipáz α és β, zsírsavamid-hidroláz, monoacilglicerol-lipáz) jelenlétét kimutatták humán és patkány vázizomban (Crespillo et al. 2011, Cavuoto et al. 2007), ahol a CB1 receptor expressziója az izom differenciáltsági fokától függ: myoblastokban még nem vagy alig mutatható ki, csak a terminálisan differenciálódott myotubulusokban jelenik meg (Eckardt et al. 2009, Lipina et al. 2010).

Irodalom:

Bíró T, Tóth BI, Haskó G, Paus R, Pacher P: Trends Pharmacol Sci. 2009 Aug;30(8):411-20.

Cavuoto P, McAinch AJ, Hatzinikolas G, Janovská A, Game P, Wittert GA): Biochem Biophys Res Commun. 2007 Dec 7;364(1):105-10.

Crespillo A, Suárez J, Bermúdez-Silva FJ, Rivera P, Vida M, Alonso M, Palomino A, Lucena MA, Serrano A, Pérez-Martín M, Macias M, Fernández-Llébrez P, Rodríguez de Fonseca F: Biochem J. 2011 Jan 1;433(1):175-85.

Eckardt K, Sell H, Taube A, Koenen M, Platzbecker B, Cramer A, Horrighs A, Lehtonen M, Tennagels N, Eckel J: Diabetologia. 2009 Apr;52(4):664-74.

Howlett AC: Handb Exp Pharmacol. 2005;(168):53-79.

Lauckner JE, Hille B, Mackie K: Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Dec 27;102(52):19144-9.

Lipina C, Stretton C, Hastings S, Hundal JS, Mackie K, Irving AJ, Hundal HS: Diabetes. 2010 Feb;59(2):375-85.

Pacher P, Bátkai S, Kunos G: Pharmacol Rev. 2006 Sep;58(3):389-462.

Pagotto U, Marsicano G, Cota D, Lutz B, Pasquali R: Endocr Rev. 2006 Feb;27(1):73-100.

Pertwee RG, Howlett AC, Abood ME, Alexander SP, Di Marzo V, Elphick MR, Greasley PJ, Hansen HS, Kunos G, Mackie K, Mechoulam R, Ross RA: Pharmacol Rev. 2010 Dec;62(4):588-631.

Turu G, Hunyady L: J Mol Endocrinol. 2010 Feb;44(2):75-85.

Valverde O, Torrens M: Neuroscience. 2012 Mar 1;204:193-206.






A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.