Western-blot

Western-blot

A vázizom Ca²⁺-homeosztázisában fontos szerepet játszó fehérjék (pl. rianodinreceptor, SERCA pumpa, calsequestrin, STIM1) kimutatása mellett a CB1 és CB2 receptor expresszióját hasonlítjuk össze kontroll és CB1-KO egerekből izolált izommintákban, Western-blot technika segítségével. Loading kontrollként aktint használunk azokban az esetekben, amikor a másik kimutatni kívánt fehérje molekulasúlya ezt lehetővé teszi.

A mintaként használt teljes sejt lizátumokat Western-blot analízissel vizsgáljuk. 1/5 térfogatú, 5-szörös töménységű elektroforézis mintapuffert (310 mM Tris-HCl, pH 6,8; 10% SDS, 50% glicerol, 100 mM DTT, 0,01 % brómfenol-kék) adunk a sejtlizátumokhoz, majd 5 percig 80 °C-on főzzük őket. Azonos mennyiségű, 20-40 µg fehérjét választunk szét 7,5 vagy 10%-os nátrium-dodecilszulfát-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) gélen a vizsgált fehérjék immunológiai detektálásához. Ezután a fehérjéket elektroforézis segítségével transzferáljuk nitrocellulóz membránra. Az aspecifikus kötőhelyeket PBS-ben oldott 5%-os sovány tejporral blokkoljuk, majd 4 ºC-on, egész éjszakán keresztül inkubáljuk az elsődleges antitestekkel, melyeket tejporos blokkoló oldatban hígítunk. Ezután 3-szor 10 perc PBST-vel (PBS kiegészítve 0,1% Tween 20 reagenssel) történő mosás következik, majd a membránokat 1 órán keresztül inkubáljuk a másodlagos antitestekkel. Másodlagos antitestként az elsődleges antitestet termelő faj (nyúl vagy egér) ellen kecskében termeltetett, tormaperoxidázzal (HRP) konjugált IgG-t használunk 5% sovány tejport tartalmazó PBS-ben 1:1000 arányban hígítva. A jeleket megnövelt kemilumineszcens (ECL) reakcióval hívjuk elő, az intézetünkben rendelkezésünkre álló Gel Logic 1500 előhívó rendszerrel.

http://www.bio-rad.com/en-us/sku/170-3836-mini-trans-blot-cell-powerpac-hc-power-supply

 

A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

Konfokális mikroszkópia

Konfokális mikroszkópia

Kísérleteink során a Zeiss LSM 510 META ill. LSM 5 Live konfokális mikroszkópokat line-scan üzemmódban használjuk. A Rhod-2 Ca²⁺-kötő festékkel feltöltött FDB izomrostokról felvett kétdimenziós x-y képen egy, a rost hossztengelyével párhuzamos vonalat húzunk számítógépes program segítségével. A konfokális mikroszkóp lézere ezután ezen a vonalon pásztázik az általunk megadott paraméterek szerint. Az így kapott kép az adott vonalon a mérés alatt végbement fluoreszcenciaintenzitás-változást mutatja be az idő függvényében. A felvételek fluoreszcenciáját (F) az alap fluoreszcenciára (F₀; a sejtek nyugalmi fluoreszcencia-intenzitása a tranziensek előtt) normalizáljuk, majd a tranziensek amplitúdóját deltaF/F₀-ként határozzuk meg. A line-scan üzemmódban készített felvételeket az izomrostok elektromos ingerlésével kiváltott Ca²⁺-tranziensek rögzítésére használjuk.

 

Az ábra bal oldalán egy L6 myoblast tenyészet x-y képe látható, a sárga vonal jelöli a line-scan mérés helyét. A mérés során a mikroszkóp lézere csak ezen a vonalon pásztázik, és rögzíti a fluoreszcencia-intenzitás változását az idő függvényében. A jobb oldalon látható a kész line-scan kép, aminek a függőleges tengelye mutatja a sárgával jelölt vonal egyes pixeleinek a fluoreszcencia intenzitását az adott időpillanatban, a vízszintes tengelye pedig ennek a megváltozását az idő függvényében.

A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

Egyedi sejteken történő fluoreszcens, intracelluláris [Ca2+]-mérés

Egyedi sejteken történő fluoreszcens, intracelluláris [Ca²⁺]-mérés

A C2C12 sejtek ill. FDB izomrostok intracelluláris [Ca²⁺] változásait Fura-2-AM fluoreszcens Ca²⁺-kötő festék segítségével mérjük. A feltöltést 37 °C-on, termosztátban, 60 percen át végezzük. A sejtekbe juttatott festék 340 és 380 nm hullámhosszúságok között váltakozó gerjesztését a Photon Technology International (PTI) Delta Scan^TM kettős monokromátoros berendezés biztosítja. A Fura-2 által kibocsátott fluoreszcens fényt 510 nm-en interferenciaszűrő közbeiktatásával egy fotoelektron-sokszorozó (PMT) segítségével detektáljuk. A két hullámhosszon történő gerjesztés során mért fluoreszcencia-értékek hányadosából (R=F₃₄₀/F₃₈₀) az alábbi egyenlet alapján számítjuk ki az intracelluláris [Ca²⁺]-t: [Ca²⁺]_i=K_D∙β∙(R-R_min)/(R_max-R). A sejteket illetve izomrostokat folyamatosan perfundáljuk normál Tyrode-oldattal egy külső perfúziós rendszer segítségével, és a különböző mérőoldatokat egy lokálperfúziós rendszeren keresztül adagoljuk közvetlenül a vizsgálni kívánt sejtekre.

A PTI Delta Scan mérőrendszer felépítése. A sejtekben lévő Ca²⁺-érzékeny festéket 340 és 380 nm hullámhosszon gerjesztjük, majd az emissziót 510 nm-en detektálva, a hányadosukból az intracelluláris Ca²⁺-koncentráció kiszámítható.

A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

FDB preparálás

FDB preparálás

Kontroll C57BL/6 illetve CB1 KO egér hátsó lábainak flexor digitorum brevis (FDB) izmát az állatok túlaltatása és cervikális diszlokációja után kipreparáljuk, majd 0,2%-os I. típusú kollagenázt tartalmazó oldatban 37 °C-on 60 percig emésztjük. Emésztés után az izmokat 4 °C-ra tesszük overnight, majd másnap pipettával történő óvatos triturálással egyedi izomrostokat izolálunk. Az izomrostokat lamininnel borított fedőlemezre szélesztjük a jobb kitapadás érdekében.

Minden kísérletet a Debreceni Egyetem Munkahelyi Állatkísérleti Bizottság felügyelete mellett az Európai Közösség (86/609/EEC) intézményének irányelvei alapján folytatunk.

 

Egér hátsó lába, feltárva az FDB izom kiszedéséhez (felső panel) és a kollagenázos emésztés után izolált egyedi izomrost (alsó panel), amin a méréseket végezzük.

A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.