Konfokális mikroszkópia

Konfokális mikroszkópia

Kísérleteink során a Zeiss LSM 510 META ill. LSM 5 Live konfokális mikroszkópokat line-scan üzemmódban használjuk. A Rhod-2 Ca²⁺-kötő festékkel feltöltött FDB izomrostokról felvett kétdimenziós x-y képen egy, a rost hossztengelyével párhuzamos vonalat húzunk számítógépes program segítségével. A konfokális mikroszkóp lézere ezután ezen a vonalon pásztázik az általunk megadott paraméterek szerint. Az így kapott kép az adott vonalon a mérés alatt végbement fluoreszcenciaintenzitás-változást mutatja be az idő függvényében. A felvételek fluoreszcenciáját (F) az alap fluoreszcenciára (F₀; a sejtek nyugalmi fluoreszcencia-intenzitása a tranziensek előtt) normalizáljuk, majd a tranziensek amplitúdóját deltaF/F₀-ként határozzuk meg. A line-scan üzemmódban készített felvételeket az izomrostok elektromos ingerlésével kiváltott Ca²⁺-tranziensek rögzítésére használjuk.

 

Az ábra bal oldalán egy L6 myoblast tenyészet x-y képe látható, a sárga vonal jelöli a line-scan mérés helyét. A mérés során a mikroszkóp lézere csak ezen a vonalon pásztázik, és rögzíti a fluoreszcencia-intenzitás változását az idő függvényében. A jobb oldalon látható a kész line-scan kép, aminek a függőleges tengelye mutatja a sárgával jelölt vonal egyes pixeleinek a fluoreszcencia intenzitását az adott időpillanatban, a vízszintes tengelye pedig ennek a megváltozását az idő függvényében.

A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

Egyedi sejteken történő fluoreszcens, intracelluláris [Ca2+]-mérés

Egyedi sejteken történő fluoreszcens, intracelluláris [Ca²⁺]-mérés

A C2C12 sejtek ill. FDB izomrostok intracelluláris [Ca²⁺] változásait Fura-2-AM fluoreszcens Ca²⁺-kötő festék segítségével mérjük. A feltöltést 37 °C-on, termosztátban, 60 percen át végezzük. A sejtekbe juttatott festék 340 és 380 nm hullámhosszúságok között váltakozó gerjesztését a Photon Technology International (PTI) Delta Scan^TM kettős monokromátoros berendezés biztosítja. A Fura-2 által kibocsátott fluoreszcens fényt 510 nm-en interferenciaszűrő közbeiktatásával egy fotoelektron-sokszorozó (PMT) segítségével detektáljuk. A két hullámhosszon történő gerjesztés során mért fluoreszcencia-értékek hányadosából (R=F₃₄₀/F₃₈₀) az alábbi egyenlet alapján számítjuk ki az intracelluláris [Ca²⁺]-t: [Ca²⁺]_i=K_D∙β∙(R-R_min)/(R_max-R). A sejteket illetve izomrostokat folyamatosan perfundáljuk normál Tyrode-oldattal egy külső perfúziós rendszer segítségével, és a különböző mérőoldatokat egy lokálperfúziós rendszeren keresztül adagoljuk közvetlenül a vizsgálni kívánt sejtekre.

A PTI Delta Scan mérőrendszer felépítése. A sejtekben lévő Ca²⁺-érzékeny festéket 340 és 380 nm hullámhosszon gerjesztjük, majd az emissziót 510 nm-en detektálva, a hányadosukból az intracelluláris Ca²⁺-koncentráció kiszámítható.

A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

FDB preparálás

FDB preparálás

Kontroll C57BL/6 illetve CB1 KO egér hátsó lábainak flexor digitorum brevis (FDB) izmát az állatok túlaltatása és cervikális diszlokációja után kipreparáljuk, majd 0,2%-os I. típusú kollagenázt tartalmazó oldatban 37 °C-on 60 percig emésztjük. Emésztés után az izmokat 4 °C-ra tesszük overnight, majd másnap pipettával történő óvatos triturálással egyedi izomrostokat izolálunk. Az izomrostokat lamininnel borított fedőlemezre szélesztjük a jobb kitapadás érdekében.

Minden kísérletet a Debreceni Egyetem Munkahelyi Állatkísérleti Bizottság felügyelete mellett az Európai Közösség (86/609/EEC) intézményének irányelvei alapján folytatunk.

 

Egér hátsó lába, feltárva az FDB izom kiszedéséhez (felső panel) és a kollagenázos emésztés után izolált egyedi izomrost (alsó panel), amin a méréseket végezzük.

A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.

In vitro erőmérés

In vitro erőmérés

Az izomerő specifikusabb vizsgálatához izolált izomrostokon végzünk erőméréseket, elektromos ingerlés hatására. E mérések során ki tudjuk küszöbölni az olyan viselkedési és idegrendszeri eredetű hatásokat, amelyek az élő állatokkal végzett kísérletekben befolyásolhatják a kapott eredményt.

Kontroll és CB1 KO egerek hátsó lábaiból lassú típusú soleus és gyors típusú extensor digitorum longus (EDL) izmokat preparálunk, majd oxigenizált Krebs oldattal folyamatosan perfundált mérőkádba helyezzük, és kapacitív erőmérő berendezéshez rögzítjük őket. Az izmokat platina elektródok segítségével elektromosan stimuláljuk. Az erőválaszokat 2 kHz-en Digidata 1200 A/D kártya használatával digitalizáljuk, az adatok tárolására Axotape szoftvert használunk. Az egyedi izom-összehúzódások kiváltásához mindkét izomtípust 5 V-on ingereljük 2 ms-ig, EDL esetében 0,5 Hz, soleus esetében 0,25 Hz frekvencia mellett. Az egyes izmokat 10 egyedi kontrakció amplitúdójának átlagával jellemezzük. A tetanusz kiváltásához EDL esetében 100 Hz-en 200 ms-ig, soleus vizsgálatakor 50 Hz-en 500 ms-ig ingereljük az izmokat, 0,25 Hz frekvenciájú, 10 db tetanuszt tartalmazó kontrakció-sorozat segítségével. Az összehúzódások vizsgálatát követően az izmok tömegét és átmérőjét is lemérjük.

A mérések során kontroll és CB1-KO egerekből izolált izmokat hasonlítunk össze, valamint a kannabinoid agonista 1 µM WIN 55,212-2 hatását is vizsgáljuk az izomösszehúzódásokra.

 

 

Az erőmérő rendszer felépítése (felső panel) és a mérőkarhoz rögzített soleus izom (alsó panel)

A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú „Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program” című kiemelt projekt keretei között valósult meg.